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用鹽析方法分離與純化蛋白質

時間:2012-02-27 23:47|來源:實驗室前沿| | 分享|點擊:


①原理:鹽析法對于許多非電解質的分離純化都是適合的,也是蛋白質和酶提純工作應用最早,至今仍廣泛使用的方法。其原理是蛋白質、酶在低鹽濃度下的溶解質隨著鹽液濃度升高而增加(此時稱為鹽溶);當鹽濃度不斷上升時,蛋白質和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出,稱為蛋白質的鹽析。這一現象是由于蛋白質分子內及分子間電荷的極性基團有著靜電引力,當水中加入少量鹽類時,由于鹽類離子與水分子對蛋白質分子上的極性基團的影響,使蛋白質在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時,蛋白質表面的電荷大量被中和,水化膜被破壞,于是蛋白質就相互聚集而沉淀析出。鹽析法就根據不同蛋白質和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。 copyright dedecms

 
  ②鹽的選擇:蛋白質鹽析常用中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最廣的是硫酸銨,其優點是溫度系數小而溶解度大(25℃時飽和溶解度為4.1mol/L,即767g/L;0℃時飽和溶解度為3.9mol/L,即676g/L),在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來,而且硫酸銨價廉易得,分段效果比其他鹽好,不容易引起蛋白質變性。應用硫酸銨時,對蛋白氮的測定有干擾,緩沖能力比較差,故有時也應用硫酸鈉,如鹽析免疫球蛋白,用硫酸鈉的效果也不錯,硫酸鈉的缺點是30℃以上溶解度太低。其他的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好,但也由于溶解度太低,受溫度影響大,故應用不廣。
  硫酸銨濃溶液的pH在4.5~5.5之間,市售的硫酸銨常含有少量游離硫酸,pH值往往降至4.5以下,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節 。
 
  ③硫酸銨飽和度計算法及加入方式:在分段鹽析時,加鹽濃度一般以飽和度表示,飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時其溶液飽和度調整方法有3種。一是當蛋白質溶液體積不大,所需調整的濃度不高時,可加入飽和硫酸銨溶液;飽和硫酸銨配制方法可加入過量的硫酸銨,熱至50~60℃保溫數分鐘,趁熱濾去沉淀,再在0℃或25℃下平衡1~2天,有固體析出時即達100%飽和度。鹽析所需飽和度可按下式計算:
  式中V及V0分別代表所需飽和度硫酸銨溶液及原溶液的體積,S2及S1分別代表所需達到的和原溶液的飽和度。嚴格來說,混合不同體積的溶液時,總體積會發生變化使上式造成誤差,但這由體積改變所造成的誤差一般小于2%。故可忽略不計。另一種是所需達到飽和度較高而溶液的體積又不再過分增大時,可直接加入固體硫酸銨,其加入量可按下式計算:
  式中X是將1升飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時所需硫酸銨的重量(g),G及A為常數,與溫度有關。G在0℃時為707,20℃時為0.29。為方便起見,在室溫及℃時所需硫酸銨的飽和度可直接查表2-1、表2-2求出。
表2-1 室溫下由S1提高到S2時每升加固體硫酸銨的克數
  0.10 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
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0 55 113 114 175 209 242 278 312 350 390 430 474 519 560 608 657 708 760
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0.20     29 59 90 121 154 188 225 260 298 337 379 420 465 512 559 610
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0.30         30 61 93 125 160 195 232 270 310 351 394 439 485 533
0.35           30 62 94 128 163 199 235 275 315 358 403 449 495
0.40             31 63 96 131 166 205 240 280 322 365 410 458
0.45               31 64 98 133 169 206 245 286 330 373 420
0.50                 32 63 100 135 172 211 250 292 335 380
0.55                   33 66 101 138 176 214 255 298 344
0.60                     33 67 103 140 179 219 261 305
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Tags:純化,蛋白質,分離,方法,鹽析,用,
責任編輯:何輝

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