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應用蛋白質工程改造TFPI

時間:2010-04-12 03:47|來源:實驗室前沿| | 分享|點擊:


應用蛋白質工程改造TFPI,主要目的是減少其在肝臟的攝取,從而延長半衰期,降低用藥劑量和減少給藥次數。

內容來自dedecms

    TFPI1-161是TFPI的缺失突變體,主要包括前兩個Kunitz結構域及N端。該突變體由于缺少K3和C端,半衰期明顯延長,但同時其抗凝活性不及野生型,而且喪失了抗炎等非抗凝功能。如何盡最大可能地保全TFPI結構和功能,同時延長其半衰期,是TFPI的蛋白質工程的關鍵。
    TFPI在體內主要通過肝細胞膜表面受體LRP介導進入細胞而被代謝清除。LRP是一種由相對分子質量為515 000和85 000兩個亞基組成的巨型細胞膜糖蛋白,屬低密度脂蛋白受體家族成員,能夠介導多種血漿蛋白在肝細胞內的分解代謝。LRP的胞外區,即相對分子質量為515 000亞基,由4個串聯的配體結合結構域組成,分別稱之為clusters I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。每個配體結合結構域又分別由一定數目的LDL受體A型亞結構域(為A型半胱氨酸重復序列)組成。TFPI通過K3和C末端與LRP分子的dustersⅡ和clustersⅣ結合,其中clustersⅡ的C3—C7亞結構域(即LDLRA3~LDLRA7)為配體結合所必需。減弱TFPI與LRP分子間作用力,可以減少TFPI在肝臟的代謝。
    從美國國家生物技術信息中心的蛋白質結構數據庫獲取TFPI的K3結構域和LRP的C3亞結構域的空間結構解析數據,以此為基礎,在SGI  02計算機工作站上,應用InsightⅡ軟件包進行K3+C末端的同源模建,并將其與LRP的C3亞結構域進行分子對接,搜***3+C末端分子中距離分子間相互作用面最近的極性氨基酸殘基。結果發現TFPI的K241、K254、K260和K261氨基酸殘基在與LRP的分子間相互作用中發揮重要作用,其中K254距離LRP分子最近。

本文來自織夢

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TFPI和LRP之間的分子對接 copyright dedecms

TFPI—Mutl與LRP分子對接 織夢好,好織夢

TFPI—Mut4與LRP分子間對接 本文來自織夢

 
    將Lys254單一位點或將Lys241、254、260、261四個位點突變為Ala設計分子TFPI—Mutl和TFPI—Mut4.然后通過計算機進行分子比對。結果顯示TFPI及其突變體的第190~230位殘基空間構象保守,將其相對固定后,由于突變體的C末端極性發生一定變化,導致其空間構象發生了明顯變化,表現為以TFPI、TFPI—Mutl、TFPI—Mut4順序呈一定程度的順時針旋轉。對于LRP,配體受體結合時的相互作用、契合效應對其空間構象影響甚微。這說明經過這些位點的突變可以導致配體—受體復合物空間結構的變化。結果顯示,TFPI、TFPI—Mutl、TFPI—Mut4與LRP的對接復合物的相對吉布斯自由能分別為-293.51 kcal/mol -242.72kcal/mol和-230.56 kca/mol,表明其分子間作用力呈顯著下降趨勢。
    在計算機模擬和蛋白質分子設計的基礎上,以野生型TFPI基因為模板,用PCR方法引入突變,構建表達質粒pET—28a(+)—TFPI—Mutl和pET—28a(+)—TFPI—Mut4。然后參照野生型TFPI的基因表達、蛋白質復性及純化方式,用大腸桿菌制備重組的TFPI—Mutl和TFPI—Mut4。試驗證實TFPI—Mutl和TFPI—Mut4保持了與TFPI基本相當的抗凝活性,而且半衰期較TFPl分別延長1.62和4.22倍。

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Tags:改造,工程,應用,TFPI,分子,LRP,結構,TFPIMu
責任編輯:何輝

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