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免疫親和層析柱上洗脫抗原方法

時間:2010-10-17 01:09|來源:實驗室前沿| | 分享|點擊:


   實際上,從免疫親和層析柱上洗脫抗原很快且較容易。大多數工作是花費在設計和用于摸索各種有效的洗脫條件。可以采用三種方法進行洗脫,以阻斷抗原抗體之間的相互作用:①用較強烈的條件處理;②加入模擬結合位點的飽和量小分子化合物,和/或③使用一種能引起構象改變而使抗原釋出的試劑。

內容來自dedecms

    最常用的洗脫方法是基于破壞抗體與抗原之間的結合鍵。洗脫的條件可以較為強烈,使抗體和抗原變性,或采用比較溫和,使抗原和抗體仍保持原來活性。
    采用相對強烈的洗脫條件根據所用抗體而定。如果使用親和純化的多克隆抗體,抗原的洗脫條件可以和用于純化抗體的條件相同。否則洗脫條件只能根據實驗經驗來確定。可以通過測試一系列緩沖液來建立洗脫條件。
    當所用的抗體是針對一種合成肽時,通過加入一種超過克分子量的合成肽,有時即可將抗原洗脫。當抗原抗體間的作用發生解離,過量的肽結合到柱上就抑制了抗原重新結合,因而被洗脫。盡管這種方法極富吸引力,包括溫和的洗脫條件,但達到有效的洗脫常很困難。關鍵性的變化因素包括抗原抗體結合的解離率和抗體對肽與整個抗原的相對親和力。因為抗體是針對肽而產生的,它們通常可有效地與肽結合,所以主要問題是解離率。就洗脫而言,最有效的方法是將多肽與抗原抗體柱接觸直到建立新的平衡。借助高親和力的作用,可以采取延長反應時間或加入過量的肽。為了測試洗脫條件,可將遞增量的肽加至一支小層析柱內。將洗脫緩沖液流速調到盡量慢,以增加肽與層析柱的接觸時間。如果肽本身不能充分有效洗脫,可將高濃度的肽與不同的洗脫緩沖液相結合,將小量試驗得出的洗脫條件再擴大應用于大規模洗脫。
    第三種洗脫方法是根據用合適的配體處理抗原抗體柱引起變構,這種方法僅適用于某些蛋白。這些變構改變包括用ATP或小的輔助因子處理抗原而引起的構象改變。識別這些構象改變的抗體,或能與構象改變而解離的蛋白—蛋白復合物相結合的抗體可以用于制備各種純的蛋白。由于這類洗脫方法因抗原不同而異,在此不作詳細介紹。但可以提供一種有效的和獨特的洗脫方法。
    1.準備工作
    此法最大的難點是確定恰當的洗脫條件。為了獲得一個清晰的洗脫峰形和較純的抗原,需要花費大量的時間進行試驗和調整洗脫條件。
    2.所需溶液和特別設備
    預洗脫緩沖液;
    洗脫緩沖液;
    中和緩沖液;
    簡便的層析裝置;透析袋及相應的裝置。
    如果是對蛋白層析很有經驗者可采用分段增加洗脫條件而不采用逐步洗脫。
    3.操作步驟
    (1)用20倍柱床體積的預洗脫緩沖液洗柱,以更換柱內的緩沖液。推薦的預洗脫緩沖液。
    (2)采用分段洗脫,連續以0.5倍柱床體積的洗脫緩沖液流經層析柱,用EP管分別收集各組分,如果洗脫液pH值偏高或偏低,收集管中需加入0.1柱床體積的中和緩沖液。
免疫親和層析柱分部收集
    (3)測試每管抗原量,將含量高的各管合并,根據抗原的用途,可將獲得的蛋白洗脫液透析去鹽或改變緩沖液。
    (4)再用20倍柱床體積的起始緩沖液通過柱基質,使層析柱再生。加入0.01%硫柳汞,可以長期貯存(4℃)。
Tags:方法,親和,免疫,抗原,抗體,條件,緩沖,結合,可以,采用,
責任編輯:何輝

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