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免疫金銀染色雙PAG操作方法

時間:2011-07-12 01:00|來源:實驗室前沿| | 分享|點擊:


免疫金銀染色方法敏感、簡便、省時、安全可靠,葡萄球菌A蛋白(SPA)金標記四步法是在此基礎上發展起來的更為敏感的一種新方法。SPA和許多哺乳類動物IgG具有親和性,且它們之間的連接不會干擾抗原—抗體的結合。簡單的SPA金標記二步法后,第三步用抗SPA與SPA金表面分子通過Fab或Fc段相結合,結果結合更多的膠體金顆粒,再通過銀增強,使原始信號得到幾何級放大,其染色原理見圖。

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雙PAG免疫金銀染色原理
 
    (一)染色流程:
    (1)石蠟切片常規脫蠟至水,0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min。
    (2)0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原修復20min(98℃),自然冷卻至室溫。
    (3)0.05mol/L(pH7.4) TBS洗3×3min。
    (4)1%EA(卵蛋白)15min,不洗。
    (5)適當稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min。
    (6)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×5min。
    (7)0.02mol/L(pH7.4)TBS(內含0.1%BSA)洗10min。
    (8)1%EA 15min,不洗,滴加PAGlonm 1:40稀釋,室溫1h,
    (9)0.05mo!/L(pH7.4)TBS洗10min。
    (10)兔抗SPAIgGl:400稀釋,37℃ 30min。
    (11)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
    (12)滴加PAGlonm 1:60稀釋,室溫1h,或37℃ 30min。
    (13)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
    (14)1%戊二醛洗10min。
    (15)雙蒸水洗5min。
    (16)1%明膠洗5min。
    (17)銀避光顯影8~15min。
    (18)雙蒸水洗15min。
    (19)固定:用顯影定影液(1:4或1:10)固定5min,也可以用15%硫酸鈉—20%硫代硫酸鈉混合液固定1~3rain,或用1%戊二醛固定5min,50℃溫水洗3~6min。
    (20)襯染:核固紅襯染3min或甲基綠襯染3min。
    (21)常規脫水,樹膠封片。
    (22)鏡檢:陽性物質呈黑色或黑褐色,顆粒分布于抗原—抗體反應部位;背景較干凈,呈紅色。
 
    (二)雙PAG法的敏感性
    應用本法對keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等組織抗原的定位,連續4gm石蠟切片,同時用IGSS和雙PAG法,不同的一抗稀釋度,結果雙PAG法要比IGSS法敏感5~8倍,抗體的稀釋度從1:  (1000~5000)提高到1:  (10000—50000),大大節約了第一抗體。尤其組織細胞內抗原性較弱,抗原丟失嚴重,應用雙PAG法均能得到有效的檢測,陽性檢測率和陽性強度有了明顯的提高。某些抗原用單一的SPA金標探針對某些抗原只能獲得低強度的染色,當用雙PAG法時可獲得強的特異性染色。
Tags:操作,方法,金銀,免疫,
責任編輯:何輝

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