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噬菌體滴度的測定操作規程

時間:2012-04-10 23:39|來源:實驗室前沿| | 分享|點擊:


在宿主細胞過量的情況下,噬斑的數量隨著噬菌體的增加呈線性增加。由于這個原因,在感染以前,要將噬菌體進行稀釋,而不是將宿主細胞稀釋。以低MOI(感染重復性)鋪板,也可確保每一個噬斑僅包含一個DNA序列。

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【材料和試劑】
(1)微波爐
(2)LB/IPTG/Xgal培養板
(3)LB培養基
(4)頂層瓊脂糖凝膠
 
【操作步驟】
(1)在5~10ml LB培養基中接種單個ER2537克隆,振搖孵育直至對數生長中期(OD600~0.5)
(2)在細胞生長時,微波融化頂層瓊脂糖凝膠,分裝至無菌培養管內,每管3ml。維持在45℃備用。
(3)37℃預熱LB/IPTG/Xgal培養板,備用。
(4)以LB培養基10倍比稀釋噬菌體。
    建議稀釋范圍:對擴增的噬菌體培養上清,108-1011;對未擴增的篩選洗脫液,101-104。每次稀釋都換用新的加樣槍頭,最好使用氣溶膠阻隔槍頭以避免交叉污染。
(5)一旦ER2537培養物長至對數生長中期,分裝至微量離心管中,每管200ml。
(6)將倍比稀釋的噬菌體上清加入含細菌培養物的微量離心管中,一支微量離心管中僅加入一種稀釋液10ml,快速渦旋,室溫孵育1-5min。
(7)轉移至含有45℃頂層瓊脂糖凝膠的管中,快速渦旋混勻,立即傾倒至預熱的LB/IPTG/Xgal平板上,輕緩搖動平板使頂層膠均勻分布。
(8)冷卻平板5min,37℃倒置培養過夜。
(9)噬斑計數以噬斑數為100左右的平皿為準,噬斑數乘以稀釋度即可獲得每10ml噬菌體的滴度-噬斑形成單位(pfu)。
Tags:操作規程,測定,滴度,噬菌體,
責任編輯:何輝

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